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　　（来源：小张聊科研 小张聊科研）

　　今天看一篇近期发表在Science上的研究：A necroptotic-to-apoptotic signaling axis underlies inflammatory bowel disease. 选择这篇文章是因为它涉及的主题对大家申报国自然项目非常有参考价值。

　　细胞死亡是大家经常做的方向，但多数研究会不自觉地假设“一种疾病对应一种死亡方式”。这篇Science展示了一种更有层次的处理方式：

　　1）在IBD这种以炎症和组织损伤为经典病理特点的疾病中，如何在“看似正常”的区域找到异常信号，从而提升研究的创新性？

　　2）如何通过不同阶段的样本揭示坏死性凋亡向凋亡的转换？

　　3）如何解析同一种凋亡在不同细胞类型中由完全不同的分子驱动？

　　这项研究回答了IBD领域一个长期被忽视的问题：为什么患者在接受先进治疗后、临床表现已经缓解的情况下，仍然会复发？这个问题和前天介绍过的那篇Immunity文章有相似之处Immunity那篇关注的是炎症消退后ECM的持续改变，这篇文章关注的是组织学缓解期上皮细胞死亡信号的持续存在。两篇文章回答的角度不同，但问题的定位策略高度一致：不比较“健康”与“重症”，而是选择“组织学看似正常”的区域寻找分子层面的异常信号。

　　研究团队通过80名患者、900多份活检样本、41种细胞死亡标志物的系统检测，结合空间转录组学和患者来源的肠道类器官，发现即使在组织学正常的区域，上皮细胞的死亡信号已经启动，并能预测未来2到3年的疾病复发。

　　具体而言，1）炎症驱动吸收性上皮细胞（吸收细胞）向M1巨噬细胞样的转录状态转变，导致其对死亡信号的敏感性增加；2）这一状态转变促进了RIPK1非依赖性的坏死性凋亡信号激活，该信号在组织学正常的区域即可检测到；3）随后，坏死性凋亡信号触发两种独立但并行的凋亡途径：iNOS辅助的线粒体凋亡驱动吸收性上皮细胞死亡，PUMA介导的线粒体凋亡驱动肠道干细胞死亡。因此坏死性凋亡信号本身不直接杀死细胞，而是以非经典方式（不依赖RIPK1、不依赖ZBP1）激活，可能通过调节局部微环境为后续凋亡铺路。

　　因此这个发现有三个角度值得参考：第一，炎症驱动的上皮细胞“跨谱系”转录状态转变：使吸收性上皮细胞获得类似M1巨噬细胞的转录特征；第二，死亡方式的转换：坏死性凋亡信号在组织学正常区域就已出现，而凋亡集中在炎症区域，体现时间和空间的双重差异；第三，细胞类型特异性的凋亡执行机制：同是线粒体凋亡，吸收性上皮细胞依赖iNOS，肠道干细胞依赖PUMA。

　　下面我们简单看一下研究的探索过程。

　　1. 临床队列的精细定位

　　研究团队收集了80名IBD患者的900多份肠道活检样本，覆盖从回肠到直肠的多个解剖部位，每个部位分别采集非炎症、边缘炎症和炎症区域的组织。多数患者处于静止期或轻度活动期，62%正在接受生物制剂或小分子治疗。这意味着在任何常规临床评估（内镜、组织学、症状评分）看来，这批患者的疾病都“控制得不错”。然而，正是在这个“控制得不错”的人群中，研究团队发现了组织学评估与分子水平之间的脱节：炎症区域的异常并不意外，真正值得关注的是“非炎症”区域中已经存在的分子信号。

　　2. 细胞死亡信号的系统检测

　　研究者用WB检测了41种细胞死亡相关蛋白的表达和修饰状态，包括磷酸化、切割等激活形式的标志物。结果显示坏死性凋亡的标志物pRIPK3和凋亡的标志物cleaved caspase-3在IBD样本中普遍升高。更关键的是空间和时间上的差异：pRIPK3在组织学非炎症区域就已经升高，而cleaved caspase-3主要集中在炎症区域。因此坏死性凋亡信号出现得更早（时间维度）、分布更广（空间维度），而凋亡信号出现得更晚、更局限。这种“坏死性凋亡在前、凋亡在后”的时空关系，提示两者之间可能存在因果关系：坏死性凋亡可能为凋亡的发生创造了条件。

　　3. 排除性证据引导非经典机制

　　一个关键的反常现象是：凋亡通路基因在转录水平确实异常，但IBD的GWAS研究并不支持经典凋亡基因的遗传关联。如果经典凋亡通路相关基因与成人IBD没有遗传关联，那观察到的凋亡信号则可能来自非经典机制。此外，组织学切片上并未观察到大量的凋亡细胞，这说明死亡信号的激活不一定会导致可识别的组织学改变。这两个阴性结果没有被忽视，而是被当作“新方向”的线索，引导研究团队排除经典模型，寻找替代机制。

　　4. 非经典机制的揭示与“跨谱系”状态转变

　　进而研究团队通过bulk RNA-seq从164个细胞死亡相关基因中鉴定出6个在炎症依赖性升高的基因：NOS2、MLKL、ZBP1、PDK1、BCL2A1和NFKB2。这些基因的表达变化集中在吸收性上皮细胞，而非免疫细胞。空间转录组进一步证实，这些改变的上皮细胞紧邻一个以浆细胞为主的免疫微环境。更关键的是，这些上皮细胞获得了类似M1巨噬细胞的转录特征，这不仅是基因表达的变化，更提示跨谱系的状态转变。炎症没有把上皮细胞变成巨噬细胞，但让它们的转录状态向巨噬细胞（样）方向偏移，使它们对死亡信号更加敏感。

　　5. 类器官验证与细胞类型特异性

　　接下来，研究者用患者来源的肠道类器官验证了IFNγ和TNF对上皮细胞的致死效应。常规的凋亡抑制剂、坏死性凋亡抑制剂、焦亡抑制剂都无法阻止类器官死亡，只有BCL-2过表达（抑制线粒体凋亡）能有效保护。说明死亡方式是线粒体凋亡。

　　更精细的机制解析显示，同样是线粒体凋亡，不同细胞类型的驱动机制完全不同。PUMA（由BBC3编码）敲除能够保护干细胞免受IFNγ+TNF诱导的死亡，但对吸收性上皮细胞没有保护效果；相反，NOS2（编码iNOS）敲除能够保护吸收性上皮细胞，但对干细胞没有保护效果：iNOS通过产生活性氮物种辅助线粒体凋亡，PUMA通过拮抗BCL-XL和MCL-1释放BAX/BAK。

　　6. 预后预测与治疗策略的启示

　　最后，在2到3年的随访中，基线pRIPK3水平升高的患者复发率显著更高，而且这种预测效应独立于常规指标（如CRP、白蛋白等）；而细胞死亡信号在接受生物制剂或小分子靶向治疗、处于缓解期的患者中仍然存在，说明现有抗炎策略虽然能压制炎症，但不能消除上皮细胞的死亡倾向。这就提示可能需要直接靶向细胞死亡通路，而不仅仅是依赖抗炎，这就对临床治疗提供了新的角度。

　　最后简单总结一下研究值得学习的地方。

　　第一，与Immunity研究类似的宏观与微观现象的“矛盾”：大多数研究会直接比较“健康”和“重症”，找到一堆差异基因。但本文选择的是“临床表现不重、但组织学分子水平存在异常”的中间状态（或者矛盾现象）。

　　第二，利用排除性证据引导新方向：GWAS数据不支持经典凋亡通路与成人IBD的关联，组织学也看不到大量的凋亡细胞。本研究把阴性结果当作新方向的线索，排除了经典模型，才走上了非经典机制的道路。

　　第三，死亡方式转换的时空维度：细胞死亡方式之间的转换不是孤立的，而是发生在具体的时间和空间坐标中。本研究中发现坏死性凋亡信号在组织学正常区域就已经存在（空间上更早出现、范围更广），而凋亡信号局限在炎症区域（空间上更局限、时间上更下游）。如果只取炎症区域的样本，会看到凋亡；如果只取非炎症区域的样本，会看到坏死性凋亡；只有同时覆盖不同区域、不同时间点的样本，才能看到两者之间的转换关系。

　　第四，转录状态转变的发现策略：如果我们只依赖单个标志物或单个时间点的表达数据，“上皮细胞获得M1巨噬细胞样转录状态”这个现象可能会被当成普通的“基因表达变化”而忽略；而本研究通过bulk RNA-seq筛选出少数几个基因，进而基于空间转录组把这些基因的表达定位到特定的细胞类型，然后才有“跨谱系状态转变”的发现。

　　第五，细胞类型特异性的机制解析：同一种死亡方式（线粒体凋亡），在不同细胞类型中由完全不同的分子驱动。iNOS对吸收性上皮细胞至关重要，但对干细胞没有影响；PUMA对干细胞至关重要，但对吸收性上皮细胞没有影响。这是因为不同细胞类型的BCL-2家族蛋白表达谱不同，导致它们对死亡信号的“解读”不同。

　　第六，临床意义的两个方面：本研究发现1）细胞死亡信号能预测复发（而非经典的诊断），这是标志物价值；2）细胞死亡信号在接受生物制剂或小分子靶向治疗下仍然存在，提示现有抗炎策略的局限性，同时也提示抗细胞死亡策略的价值。